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在单分子尺度下原位监测甲酸脱氢酶催化循环，提出其催化新机制
了解酶促反应的机制和动力学对于生命科学研究和生物工程至关重要。1951年Hugo Theorell（因发现氧化酶的作用机理于1955年获得诺贝尔生理学或医学奖）与Chance（获诺贝尔奖提名）共同提出了著名的辅酶依赖型氧化还原酶催化的Theorell-Chance机制以来，有关辅酶依赖型氧化还原酶的催化机制的研究一直是热门话题。然而，催化循环中的缔合-解离步骤尚未通过实验确定，氧化还原的机制仍然是推测性的。
鉴于此，厦门大学洪文晶教授、方柏山教授团队和王斌举教授团队合作通过利用扫描隧道显微镜断裂连接（STM-BJ）技术，通过其特征电导率区分了甲酸盐脱氢酶催化循环中的不同反应状态，并进一步利用这些电导率作为标记来监测来自Candida boidinii的甲酸盐脱氢酶的催化机制。
结合多尺度模拟，他们证明，在甲酸盐脱氢酶的催化循环过程中，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的结合还原形式直接通过原位的氢转移反应转化为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）。这种转换并不是通过传统的、普遍接受的Theorell-Chance机制中引用的apoenzyme状态进行的。这项工作对甲酸盐脱氢酶的机制提供了有趣的见解，并强调了单分子技术在揭示NADH/NAD+依赖性氧化还原酶的催化机制方面的潜力。
Figure 1. 概念图
【探索 FDH 催化反应中的中间状态】
为了表征来自Candida boidinii的FDH的催化循环，研究人员采用STM-BJ技术测量四种不同已知状态的电导：FDH-NAD+、FDH-NADH、FDH和FDH-HCO2-（图1a）。基于四个已知状态T1、T2、T5和T5 *的特征电导（如图1c所示），进一步进行STM-BJ实验以探索FDH反应过程中的中间状态及其相互转换。通过对照实验（图1d，e）发现STM-BJ可以表征具有不同峰的五个中间状态（T1、T2、T3、T4、T5）（图1d、f）。此外，在两个实验中发现五种状态中每一种的电导相似，这表明初始催化反应不受添加过量HCO 2 -或NAD +的显着影响。通过与图1c中已识别状态的电导比较，可以在催化反应期间分配T1(FDH-NAD+)、T2(FDH-NADH)和T5/T5*(FDH/FDH-HCO2-)状态，而其他未知状态标记为T3和T4。
图 1. STM-BJ 测量的单分子 FDH 结的电导
【在单分子水平上监测FDH催化循环】
为了确定反应过程中五种中间状态的催化路线，研究人员采用STM-BJ的悬停模型（方法）监测单酶反应中的实时电导演变，两个电极之间的距离固定。如图2b所示，研究人员观察到一个值得注意的部分轨迹涉及两个相邻状态的重新交叉(52.85±3.99%)，包括T3→T4→T3→T4→T3(23.50±1.69%;图2b,c))和T1→T2→T1→T2→T1(29.35±2.42%;图2b，d)。在轨迹的一小部分(12.33±0.64%)中，研究人员观察到五个独立的状态，它们是长寿命的并且在催化反应期间不循环（图2b，e）。更重要的是，研究人员观察到负责催化反应的轨迹的显着部分(34.82±3.90%)，由T2→T1→T3→T4的催化路线（5.42±0.99%；图2f）及其附属行程表示（51.65±2.33%；图2b）。这些路线表明T2(FDH-NADH)直接演化为T1(FDH-NAD+)，T1(FDH-NAD+)可能进一步与HCO2−结合形成三元复合物T3(FDH-NAD+-HCO2−)。假定T3状态将进一步转化为结合产物状态T4(FDH-NADH-CO 2)通过NAD +介导的氢化物转移反应。如图2b所示，所有捕获轨迹遵循T2→T1→T3→T4→T2的顺序。尽管监测到了大量轨迹，但研究人员无法捕获参与FDH催化行程的脱辅酶状态(T5)。因此，实时电导实验表明，Theorell-Chance机制中提出的脱辅酶状态(T5)可能在FDH的催化循环中被绕过。总而言之，基于人工智能的电导数据分析和统计结果表明，甲酸脱氢酶催化循环过程与传统的Theorell-Chance机制不同，其催化结束时不经历辅酶解离状态。
图 2. 使用 STM-BJ 悬停模型监测的单分子 FDH 反应动力学
【原位氢化物交换将FDH-NADH转化为FDH-NAD+】
为了进一步证实电导测量所揭示的 FDH 催化循环，研究人员进行了多尺度模拟，包括组合分子动力学 (MD) 模拟和量子力学/分子力学 (QM/MM) MD 模拟（图3）。他们提出反应结束后结合在甲酸脱氢酶中的还原型辅酶I通过氢负离子原位转移直接转化为氧化型辅酶I，并直接开启新的催化循环。该研究表明，新鲜NAD +可以很容易地扩散到FDH中NADH的附近，导致NAD +和NADH的两个烟酰胺部分之间的π-π堆叠相互作用。然后，新生成的NADH可以通过与新鲜NAD +的原位氢化物转移反应转化为NAD +。与实验结果一致，该计算表明NADH的酶结合亲和力比NAD +强得多，这表明通过辅酶解离状态的直接位置交换是非常不利的。
图 3. 机理研究
【总结】
本文首次在单分子尺度下观测到酶催化反应动态过程，并结合多尺度理论计算提出了单分子尺度下甲酸脱氢酶催化新机制。上述的所有这些发现对单分子酶学和氧化还原酶的催化循环都有深远的影响，同时表明单酶电导技术可能提供一种工具来探索各种氧化还原酶的催化作用。
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来源：高分子科学前沿
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