南京农业大学研究生，南京农业大学研究生院
冷鲜鸡是指经标准化屠宰后迅速进行冷却处理，使中心温度在1 h内降低至4 ℃以下，并在后续各个环节中始终维持在肉冰点以上到4 ℃范围内的鸡胴体及其分割品。假单胞菌是冷鲜鸡中最常见的菌属之一，在低温有氧的环境中可以迅速繁殖并成为优势菌群。假单胞菌是冷鲜鸡肉的特定腐败菌，其数量常作为新鲜度测定的重要指标出现在诸多研究中。环介导等温扩增（LAMP）是基于4 条引物和链置换酶，能在体外迅速完成对靶序列上亿次扩增的痕量检测技术。目前在食品领域，该技术主要应用于掺假肉和致病菌检测，检测生鲜肉的新鲜度还鲜见报道。
南京农业大学 肉品加工与质量控制教育部重点实验室的张晋豪、王浩东、王虎虎*等人基于假单胞菌的数量变化建立一种利用LAMP技术快速评价冷鲜鸡新鲜度的可行性，有可能代替操作繁琐的传统检测方法，有助于排除腐败肉引起的健康风险，促进冷鲜鸡的市场推广。
一、LAMP反应的建立与优化
如图1a所示，当嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus，Bst）DNA聚合酶添加量为0.08 U/µL时，电泳条带相对较暗且显色程度较弱，其他组颜色和条带无显著差异，为降低实验成本，选择0.16 U/µL作为反应的酶添加量；如图1b所示，当dNTP浓度为0.4～0.8 mmol/L时，无条带或条带较浅，说明扩增未发生或程度较低，当浓度为1.0 mmol/L时，电泳条带最亮且显色最显著，因此选择1.0 mmol/L作为反应的dNTP浓度；如图1c所示，当Mg2+浓度为2 mmol/L时，无电泳条带说明未扩增，当浓度为4～6 mmol/L时，电泳条带无显著差异，因浓度高有利于增加颜色变化程度，故选择6 mmol/L为反应的Mg2+浓度；如图1d所示，当内引物浓度为0.4～1.2 mmol/L时条带不显著，说明扩增未发生或反应程度低，当浓度达到1.6 mmol/L时，电泳条带清晰明亮，且反应前后颜色差异显著，因此选择1.6 mmol/L为反应的外引物浓度；如图1e所示，各引物浓度组电泳条带及颜色变化均无显著差异，说明内引物对反应影响较小，选择0.1 mmol/L为反应的内引物浓度；如图1f所示，各HNB浓度组电泳条带无显著差异，说明HNB浓度对反应无抑制作用，当HNB浓度为160 µmol/L时，颜色变化最为显著，因此选择160 µmol/L作为反应的HNB浓度；如图1g所示，当温度为59～60 ℃时，扩增程度较低且几无显色变化，当温度在61～66 ℃范围内时反应均可发生，且颜色前后变化显著，综合考虑反应的温度为61 ℃。
通过各因素不同水平的优化，得到一组合适的LAMP反应体系：1×Bst Reaction Buffer，Mg2+终浓度为6 mmol/L，dNTP终浓度为1.0 mmol/L，外引物终浓度为0.1 mmol/L，内引物终浓度为1.6 mmol/L，HNB终浓度为160 µmol/L，Bst 2.0 WarmStartTM DNA聚合酶终浓度为0.16 U/µL，细菌基因组1 µL，超纯水补足体系至25 µL，反应在61 ℃恒温1 h。
二、LAMP反应的特异性结果
如图2所示，以假单胞菌菌株基因组为模板的LAMP反应结果均呈蓝色，且有阶梯状电泳条带，LAMP反应结果为阳性；以非假单胞菌基因组为模板的LAMP反应结果均维持紫色，无电泳条带，LAMP反应结果为阴性，说明根据所设计的引物能实现对假单胞菌属细菌的特异性检测。
三、LAMP反应的灵敏度结果
如表5、图3所示，LAMP反应检测假单胞菌单菌的灵敏度在1.25×104～1.45×106 CFU/mL范围内，达到实验的基本需求。
四、LAMP反应液的吸光度检测结果
将LAMP反应液于400～780 nm波长下扫描，发现在646 nm波长处存在明显吸收峰，故可在此波长下探究吸光度和反应程度的定量关系。如图4所示，当菌液浓度为3.05×10 9 ～3.05×10 2 CFU/mL时，反应液呈蓝色，LAMP反应显阳性；菌液浓度为3.05×10 1 CFU/mL时，反应液呈紫色，LAMP反应显阴性，说明LAMP检测假单胞菌的灵敏度为3.05×10 2 CFU/mL。根据吸光度测定结果，阳性组和阴性组的吸光度存在显著差异（ P ＜0.05），因此可以通过测定扩增结束后反应液的吸光度判断结果，避免单独依靠观察颜色产生误差。参考Rukchon等实验结果，以NTC组吸光度的±3 s 为0.19，作为判定LAMP反应阳性的阈值，超过该值即认定反应结果为阳性。
五、实际样品验证结果
感官评定结果
如表6所示，C组样品的整体接受度下降最快，第3天时已低于6 分，与A、B组样品存在显著差异（P＜0.05），这表明从消费者角度评价，此时的样品已经不可接受。从外观来看，新鲜鸡肉初始颜色较为红润，其评分在整个贮藏期间下降缓慢，如B组样品在第4天评分仍在6 分以上；贮藏后期样品颜色发黄渐深，可能是好氧菌利用氧气使组织表面的氧分压降低，导致肌红蛋白被氧化成高铁肌红蛋白，使肉类呈黄褐色。气味的评分下降最快，如C组样品在第1天时就有轻微酸味，不良风味出现早于其他属性，人的嗅觉比其他感官更灵敏，因此能探查到肉品气味细微的变化。产黏的变化趋势和整体接受度同步性较高，因此该属性可能是感官评价中参考的重要指标。
理化指标结果
如图5所示，A组、B组 和C组样品的菌落总数分别在第3 天（6.17（l g（CFU/g））、第4 天（6.48（lg（CFU/g））、第3天（6.70（lg（CFU/g））超过国标限定6.00（lg（CFU/g））的标准值。虽然B组样品贮藏3 d（5.82（lg（CFU/g））、C组样品贮藏2 d（5.94（lg（CFU/g））后菌落总数仍在国标范围内，但已临近腐败阈值，综合感官评定结果确定A组、B组和C组样品的货架期分别为2、2、1 d。A组、B组和C组的初始假单胞菌数量分别为3.29、3.47、3.47（lg（CFU/g）），在低温有氧条件下，假单胞菌迅速增殖，A组（5.40（lg（CFU/g））、B组（5.47（lg（CFU/g））和C组（5.46（lg（CFU/g））样品分别在第3、3、2天时超过5.00（lg（CFU/g）），推测其与鸡肉的货架期密切相关。pH值和TVB-N值在贮藏前期增长缓慢，直到肉品进入腐败期后才开始迅速上升，存在一定的滞后性，因此更适合指示腐败肉品的新鲜度。
本研究基于Pearson相关系数探究假单胞菌数和其他理化指标的关系。如表7所示，相比于pH值和TVB-N值，同组样品中菌落总数和假单胞菌数的相关性更强；相比于色泽、产黏属性，气味与假单胞菌数的相关关系更密切，这也是消费者选购肉品时首要考虑的因素。
因此，综合3 组肉品的感官和理化指标结果，基于菌落总数和气味属性评价冷鲜鸡的新鲜度最准确，而假单胞菌数与这两个指标的相关性最强。因此，通过假单胞菌的数量推测冷鲜鸡的新鲜度具有可行性和合理性。
LAMP检测结果
如图6所示，根据假单胞菌计数和显色结果，当A、B和C组样品洗脱液中假单胞菌的数量分别达到5.40、5.47、5.46（lg（CFU/g））时，LAMP反应液吸光度超过0.19，显阳性，此时分别对应A、B和C组样品贮藏第3天（0.30）、第3天（0.28）、第2天（0.26）。根据前述测定理化指标所得冷鲜鸡的货架期结果，货架期内LAMP结果显阴性，超出货架期LAMP结果显阳性。综上所述，通过LAMP技术检测假单胞菌数量可以推测冷鲜鸡的新鲜度：若LAMP反应结果呈紫色且吸光度小于0.19，认定样品处于货架期内；若LAMP反应结果呈蓝色且吸光度超过0.19，则认为样品已腐败。
六、讨 论
LAMP技术要求确定一段靶基因设计引物，16S rRNA是原核生物核糖体中30 S亚基的组成部分，包括保守区和可变区；保守区体现种间的亲缘关系，可变区则体现种内的亲缘关系。本研究基于该片段探究假单胞菌属的通用序列，通过比对30 株假单胞菌和10 株非假单胞菌的16S rDNA序列，得到一段长度合适的高保守序列，并以此序列为基础设计引物，构建、优化LAMP体系。
本研究基于LAMP技术检测假单胞混菌的灵敏度达到3.05×10 2 CFU/mL，并进一步验证定量反应程度的可能性。通过模拟含不同浓度镁离子的LAMP体系并测试其吸光度，发现在646 nm处有显著吸收峰；检测各梯度浓度菌液扩增后的LAMP反应液吸光度，发现相邻组别无线性相关关系，仅阳性和阴性组结果存在显著差异（ P ＜0.05），因此可利用吸光度进一步确定反应结果。
本研究根据假单胞菌属通用序列构建的LAMP体系具有较好的特异性和灵敏度。通过监测冷鲜鸡肉的理化性质，发现基于菌落总数和气味属性评价肉品的新鲜度更准确，而假单胞菌数和二者相关性最强，因此利用假单胞菌数间接推测冷鲜鸡肉的新鲜度具有合理性和可行性。本研究建立了一种冷鲜鸡新鲜度的快速评价方法，可根据吸光度和肉眼观察同步判断反应结果，简化操作流程，进一步物化后存在代替传统检测方法的可能性，拥有广阔的应用前景。
作者简介
王虎虎，南京农业大学教授，聚焦于肉类动物的福利屠宰、精深加工、品质评价和防腐保鲜，以及肉源性致病菌（沙门氏菌）的定植黏附和致病侵袭等方面的科研和教学工作。主持各类科研项目18项，发表学术论文100余篇，其中以第一/通讯作者发表SCI论文50篇、中文核心20篇；参与获得国家科技进步二等奖、教育部科技进步一等奖和中国食品科学技术学会科技进步一等奖等奖励4项；授权专利8项，参与制定标准2项，获软件著作权3项，参编/译教材与书籍3部。兼任中国微生物学会分析微生物专业委员会食品学组委员、中国畜产品加工研究会青年委员会委员、江苏省食品学会青年委员会副主任委员、全国肉禽蛋制品标委会畜肉分委会委员；担任LWT-Food Science and Technology期刊编委、Frontiers in Microbiology期刊Guest Editor，国内外20余种学术期刊的审稿专家。
本文《基于LAMP技术快速检测冷鲜鸡新鲜度》来源于《食品科学》2023年44卷第6期351-359页，作者：张晋豪，王浩东，刘欣悦，陈珊珊，胡海静，徐幸莲，王虎虎。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220304-060点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
图片来源于文章原文及摄图网。
为构建多元化食物供给体系并兼顾生态环境保护，并形成以生物多样性保护促进食品生产的可持续性，北京食品科学研究院和中国食品杂志社将与北方民族大学、皖西学院、宿州学院、滁州学院于 2023年5月13-14日在中国宁夏银川 共同举办“ 生态保护与食品可持续发展国际研讨会 ”。本届研讨会将围绕新资源食品挖掘、动植物、微生物可替代蛋白、食用菌等食物资源的开发现状、重要创新进展及存在的问题开展研讨，探讨未来食品发展方向，通过展示我国生态保护与食品可持续发展等领域的最新科研成果，搭建科研单位与企业产学研结合的平台，共同促进我国食品产业发展快速踏入新里程。
Food Science of Animal Products（ISSN: 2958-4124, e-ISSN : 2958-3780）是一本国际同行评议、开放获取的期刊，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心主办，中国食品杂志社《食品科学》编辑团队运营，属于食品科学与技术学科，旨在报道动物源食品领域最新研究成果，涉及肉、水产、乳、蛋、动物内脏、食用昆虫等原料，研究内容包括食物原料品质、加工特性，营养成分、活性物质与人类健康的关系，产品风味及感官特性，加工或烹饪中有害物质的控制，产品保鲜、贮藏与包装，微生物及发酵，非法药物残留及食品安全检测，真实性鉴别，细胞培育肉，法规标准等。
投稿网址：
https://www.sciopen.com/journal/2958-4124
南京农业大学研究生(南京农业大学研究生院)
